技術(shù)服務(wù)

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。脊椎動(dòng)物DNA的甲基化狀態(tài)與生長發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)，比如在腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)的下降。

1.甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。 

特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測特異位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。

2.亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。

特點(diǎn)：精確度高，能夠準(zhǔn)確檢測出甲基化的程度百分比。

3.焦磷酸測序（Pyrosequencing）

焦磷酸測序可在一次檢測中快速定量一個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)，是較為理想的驗(yàn)證方法，該技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中逐漸成為數(shù)據(jù)分析的金標(biāo)準(zhǔn)。 靈敏度高，可測到鄰近CpG區(qū)域的單個(gè)甲基化水平 ，對(duì)于樣品要求低，適用于新鮮、冷凍和FFPE樣本，對(duì)于檢測位點(diǎn)要求低，可檢測未知序列信息，覆蓋到人類基因組的所有CpG位點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)過程：
1.引物設(shè)計(jì)及合成
2.DNA提取、質(zhì)檢
3.DNA亞硫酸氫鹽修飾
4.MSP/BSP/焦磷酸測序
5.數(shù)據(jù)分析

送樣要求：細(xì)胞（≥106 個(gè)）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等樣品材料，基因組DNA（體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl）。

提交的結(jié)果：
MSP：引物序列、實(shí)驗(yàn)報(bào)告、包括MSP產(chǎn)物的電泳圖片等

BSP：引物序列、測序峰圖、實(shí)驗(yàn)報(bào)告等

焦磷酸測序：引物序列、測序峰圖、實(shí)驗(yàn)報(bào)告等