技術(shù)服務(wù)

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指由于單個(gè)核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，這就是SNP。

 

由于SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認(rèn)為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學(xué)標(biāo)記，在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、藥物遺傳學(xué)、疾病遺傳學(xué)、疾病診斷學(xué)、以及人類進(jìn)化等研究領(lǐng)域都有著很高的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

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SNP/單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)平臺(tái)：

1. 直接測序法（PCR-測序法）
2．Taqman-MGB探針SNP分型
3．PCR-RFLP酶切SNP分型
4．PCR-LDR連接酶檢測SNP分型
5．Multiplex SNaPshot SNP分型
6．Sequenom MassArray SNP分型
7. KASP SNP分型

1．直接測序分型（PCR-測序法）

1.1 技術(shù)原理：對(duì)欲檢測片段進(jìn)行直接PCR擴(kuò)增、采用ABI 3730xl DNA測序儀測序，純合型SNP位點(diǎn)的測序峰為單一峰型，而雜合型SNP位點(diǎn)的測序峰為套峰，因而很容易將其區(qū)分開來，通過直接測序方法進(jìn)行SNP檢測的檢出率接近100%。測序分型主要通過直接測序的方法來確定位點(diǎn)的基因型，這種分型方法準(zhǔn)確性最高，但費(fèi)用大。如果需要檢測的幾個(gè)SNP位點(diǎn)正好位于一個(gè)測序單元內(nèi)（長度小于700bp），則單個(gè)位點(diǎn)的分型費(fèi)用可顯著降低，這種分型技術(shù)不失為一種良好選擇。對(duì)于準(zhǔn)確性要求特別高或樣本量特別?。◣讉€(gè)或幾十個(gè)）的項(xiàng)目，這種分型技術(shù)非常適合。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖：

1.2 服務(wù)內(nèi)容：

1. 樣品基因組DNA提取：   需收取核酸提取費(fèi)用

2. 引物設(shè)計(jì)及合成：         僅收取引物合成費(fèi)用

3. PCR擴(kuò)增及純化：          需收取PCR擴(kuò)增及純化費(fèi)用

4. ABI 3730xl測序：           測序費(fèi)用

5. 數(shù)據(jù)分析整理：             測序峰圖分析，SNPs結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告整理

1.3 適宜范圍：

1. 需要檢測的幾個(gè)SNP位點(diǎn)正好位于一個(gè)測序單元內(nèi)（長度小于600bp）的分型項(xiàng)目；

2. 對(duì)于準(zhǔn)確性要求特別高或樣本量特別?。◣资畟€(gè)）的分型項(xiàng)目，如對(duì)其它SNP分型方法準(zhǔn)確性的驗(yàn)證。

 

2．Taqman-MGB探針SNP分型

2.1 技術(shù)原理：以SNP分型檢測為例，在PCR過程中，兩個(gè)探針能與正向引物和反向引物之間的互補(bǔ)序列特異退火結(jié)合。當(dāng)探針以完整形式存在時(shí)，由于能量共振轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)只發(fā)出微弱熒光。特異的探針與相應(yīng)的等位基因雜交后，DNA聚合酶發(fā)揮5’外切酶活性，把報(bào)告熒光基團(tuán)切割下來，從而發(fā)出熒光；而SNP探針的錯(cuò)配形式不會(huì)引起切割，無熒光信號(hào)。MGB分子結(jié)合到DNA螺旋小溝，通過穩(wěn)定MGB探針/模板提高雜交穩(wěn)定性，使短至13個(gè)堿基的探針獲得高錯(cuò)配區(qū)分辯別能力。MGB探針包括一個(gè)不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)（NFQ），極大消除傳統(tǒng)淬滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，從而提高檢驗(yàn)靈敏性。

 

原理及流程示意圖：

2.2 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1. 采用最先進(jìn)的ABI 7900HT系統(tǒng)采用激光掃描并激活96/384孔板每個(gè)反應(yīng)孔的熒光染料，熒光信號(hào)通過光柵分光，經(jīng)過分離的多色熒光同時(shí)到達(dá)CCD攝像機(jī)，實(shí)現(xiàn)多色熒光同時(shí)檢測。

2. 采用ABI 專利技術(shù)的TaqMan-MGB 探針：MGB探針包括一個(gè)不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)（NFQ），極大消除傳統(tǒng)淬滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，從而提高檢驗(yàn)靈敏性，另外MGB(小溝結(jié)合物)增加Tm值，使探針設(shè)計(jì)產(chǎn)度縮短至約15bp，提高了探針設(shè)計(jì)的靈活性。

 

2.3 技術(shù)特點(diǎn)：

1. 適合位點(diǎn)少，樣本通量高的檢測，每個(gè)位點(diǎn)需要合成一對(duì)探針，探針合成費(fèi)用高；

2. 應(yīng)用ABI7900、ABI7500定量PCR儀進(jìn)行定量檢測；

3. 操作簡便，只需一步 PCR 反應(yīng)，無須純化和預(yù)處理，直接上機(jī)檢測；

4. 結(jié)果清晰，軟件分析結(jié)果界面友好，標(biāo)出每個(gè)樣本的基因型及熒光強(qiáng)度，非常直觀；

 

2.4 適用范圍：

特別適合樣本數(shù)量超過1500個(gè)以上，位點(diǎn)數(shù)量比較少的SNP分型。

 

3．限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)

3.1 技術(shù)原理：

用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，由于不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶，所以可以直接在凝膠電泳上對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行分辨。

 

原理及流程示意圖：

3.2 技術(shù)特點(diǎn)：

1. 適合位點(diǎn)數(shù)量少，樣本通量高的檢測（檢測位點(diǎn)需要有合適的酶切位點(diǎn)存在）

2. 結(jié)果清晰直觀

3.3 服務(wù)內(nèi)容：

1. 位點(diǎn)查詢，內(nèi)切酶確定購買

2. 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，調(diào)試

3. PCR擴(kuò)增特定位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物電泳檢測

4. 酶切鑒定分析，電泳檢測

5. 電泳檢測結(jié)果記錄，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

 

4．PCR-LDR連接酶檢測SNP分型

4.1 技術(shù)原理：

主要應(yīng)用連接酶檢測反應(yīng) (ligase detection reaction，LDR)技術(shù)。即在Taq DNA連接酶的作用下, 當(dāng)左右兩條寡核苷酸探針與目的DNA序列完全互補(bǔ)，并且兩條探針之間沒有空隙時(shí)才能發(fā)生連接反應(yīng)，否則連接反應(yīng)不能進(jìn)行，最后通過熒光掃描片段長度，根據(jù)測序峰移動(dòng)的膠位置，通過末端未標(biāo)記探針的3個(gè)堿基差異，確定同一位點(diǎn)的不同基因型，再通過末端未標(biāo)記探針的7個(gè)堿基差異，確定不同位點(diǎn)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP 位點(diǎn)的精確檢測。

原理及流程示意圖：

4.2  PCR-LDR技術(shù)流程：

1. 多重PCR擴(kuò)增：獲得目標(biāo)位點(diǎn)所在的片斷；

2. 多重LDR：得到長度各異的檢測產(chǎn)物；

3. 3730測序儀檢測：根據(jù)測序電泳得到不同的峰值；

4. 判斷SNPs結(jié)果，數(shù)據(jù)分析；

 

4.3 方法特點(diǎn)：

1. 通用性強(qiáng)：適用任何多態(tài)性位點(diǎn)和各種SNP位點(diǎn)的分型，不需要人工引入酶切位點(diǎn)；

2. 分型準(zhǔn)確，檢出率高：其準(zhǔn)確度可達(dá)99.2%以上。

3. 檢測快速：LDR技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是實(shí)驗(yàn)時(shí)間短！與Taqman、RFLP、SSCP和DHPLC相比，由于檢測條件更易控制，從DNA樣本到數(shù)據(jù)的產(chǎn)出，整體實(shí)驗(yàn)只需要幾周。

 

4.4 適宜范圍：

適宜 100-1000個(gè)樣品，1-5個(gè)位點(diǎn)；

5．Multiplex SNaPshot SNP分型

5.1 技術(shù)原理：

在一個(gè)含有測序酶，四種熒光標(biāo)記的ddNTP,緊挨多態(tài)位點(diǎn)5’端的不同長度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)ABI測序儀跑膠后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型，根據(jù)峰移動(dòng)的膠位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)。對(duì)于PCR產(chǎn)物模板可通過多重PCR反應(yīng)體系來獲得，通常用于6-30個(gè)SNP位點(diǎn)分析。

技術(shù)原理：

5.2 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1. 分型準(zhǔn)確：該技術(shù)也稱微測序技術(shù)，其準(zhǔn)確度僅亞于直接測序；

2. 多位點(diǎn)同時(shí)檢測：最多可同時(shí)檢測12個(gè)位點(diǎn)；

3. 可檢測出受污染的樣本：如果一個(gè)樣本的分型峰譜偏離正常的分布，它可提示該樣本可能受到污染或濃度過低；

 

5.3 適宜范圍：

適合中高通量SNP檢測，位點(diǎn)范圍6-50個(gè)，樣本量范圍100-3000個(gè)。

 

6．Sequenom MassArray分型

6.1 技術(shù)原理:先通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP位點(diǎn)上，延伸 1個(gè)堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)強(qiáng)激光激發(fā)，核酸分子離解吸附為單電荷離子，電場中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點(diǎn)信息。

 

原理及流程示意圖：

6.2 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1. 高通量檢測,簡單靈活:采用Sequenom 384芯片平臺(tái)，能為受檢樣品設(shè)計(jì)最高可達(dá)30重的PCR反應(yīng)，從而通過一次實(shí)驗(yàn)即可獲得每個(gè)樣品多達(dá)30個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性研究數(shù)據(jù)，節(jié)省檢測經(jīng)費(fèi)，縮短檢測時(shí)間，提高了檢測效率。用戶可以自行定義待測SNP位點(diǎn)和樣品數(shù)，每天能夠檢測6張384芯片/臺(tái)儀器，單個(gè)樣品一次最多可檢測30多個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)檢出率≥90%，樣品檢出率＞95%，重復(fù)性＞98%；

 

2. 結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高：結(jié)合單堿基延伸技術(shù),利用質(zhì)譜直接檢測物質(zhì)分子量，MassArray反應(yīng)體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯(cuò)配干擾，也不需要引入各種熒光標(biāo)記物，有效避免由于熒光標(biāo)記效率導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性強(qiáng)，結(jié)果重復(fù)性好；

 

6.3 適宜范圍：適合中高通量SNP檢測,簡單靈活,結(jié)果準(zhǔn)確,靈敏度高,價(jià)格實(shí)惠;

 

7. KASP SNP分型

7.1 技術(shù)原理:

KASP-競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR），該技術(shù)是基于引物末端堿基的特異匹配來對(duì)SNP分型以及檢測InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)，采用2個(gè)熒光探針、2個(gè)通用淬滅探針，再加多個(gè)位點(diǎn)特異探針來檢測多個(gè)SNP位點(diǎn)，采用全自動(dòng)核酸提取儀、熒光定量PCR平臺(tái)，靈活采用96孔板、384孔板，一天可檢測幾萬個(gè)SNP 位點(diǎn)。

KASP技術(shù)原理上類似Taqman檢測，也是基于終端熒光讀取判斷，每孔采用雙色熒光檢測一個(gè)樣本的一個(gè)位點(diǎn)可能的兩種基因型，而KASP技術(shù)與Taqman技術(shù)不同的是，它不需要每個(gè)SNP位點(diǎn)都去合成特異的熒光引物，它基于自己獨(dú)特的ARM PCR原理，讓所有的位點(diǎn)檢測最終都使用通用熒光引物擴(kuò)增，這大大降低了LGC KASP的試劑成本，既有金標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確，又降低了使用成本，比Taqman還具有更好的位點(diǎn)適應(yīng)性，所以在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)檢測方面KASP都有非常好的應(yīng)用。

7.2 KASP技術(shù)特點(diǎn)：
1.優(yōu)異的準(zhǔn)確性
- 獨(dú)立評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性>99.8% 
- 業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的SNP&InDel 分析的轉(zhuǎn)化率(>90%)
2.超強(qiáng)的靈活性
- 設(shè)計(jì)的高度靈活性帶來更高的成功率
- 支持低/中/高通量研究以及單個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)
- 對(duì)液體處理系統(tǒng)，PCR儀和熒光分析儀等設(shè)備有良好的兼容性
3.前所未有的低成本
- 無需昂貴的雙色標(biāo)記探針，同樣成本獲得兩倍數(shù)據(jù)量
- 最低的DNA樣本需求 (根據(jù)基因組大小不同只需 0.1-10 ng) 
- 無需全基因組擴(kuò)增 (Whole Genome Amplification, WGA)

由于KASP實(shí)驗(yàn)方案的高度靈活性，其應(yīng)用也十分廣泛，適合于各種基因分型研究，無論是中低通量SNP研發(fā)項(xiàng)目，NGS之后的SNP驗(yàn)證，農(nóng)業(yè)種群研究，或者大量種子的生產(chǎn)QC和生物樣品庫 DNA Biobanking等都是其適用的范圍。

實(shí)驗(yàn)步驟：

散點(diǎn)圖結(jié)果：

服務(wù)內(nèi)容：根據(jù)客戶的要求和課題特點(diǎn)，提供一站式SNP基因分型服務(wù)

1、課題的設(shè)計(jì)咨詢包括檢測位點(diǎn)的篩選；

2、全血和組織樣本基因組DNA提取（費(fèi)用另算）；

3、DNA樣本的質(zhì)檢；

4、根據(jù)樣品數(shù)量和分型位點(diǎn)數(shù)，推薦成本最低的分型方法；

5、SNP分型所用引物的設(shè)計(jì)、合成與優(yōu)化；

6、SNP基因分型；

7、分型數(shù)據(jù)的質(zhì)量質(zhì)控；

8、提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告

 

分型數(shù)據(jù)的質(zhì)量質(zhì)控：

1、陰性陽性對(duì)照：每批分型實(shí)驗(yàn)都設(shè)計(jì)陰性（H2O）、陽性對(duì)照；

2、重復(fù)對(duì)照：在實(shí)驗(yàn)完成后隨機(jī)選取5%的樣品做重復(fù)實(shí)驗(yàn)（單獨(dú)收費(fèi)）；

3、測序驗(yàn)證：隨機(jī)選取2%的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證（單獨(dú)收費(fèi)）。

 

客戶需要提供：

1. 細(xì)胞（≥106 個(gè)）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等樣品材料，核酸提取費(fèi)用單獨(dú)收費(fèi)；

2. 基因組DNA（體積≥30μl，濃度≥50 ng/μl），純度 OD260/280 為1.7～1.9之間；

3. 人類基因組需提供SNP位點(diǎn)的RS號(hào)。其它物種如牛、雞、魚等無rs號(hào)的，需提供SNP位點(diǎn)上下游各200bp的確切序列，SNP位點(diǎn)的突變類型，以及位點(diǎn)的上下游25bp內(nèi)是否存在其它連鎖位點(diǎn)。

 

最終提交結(jié)果：

1. SNPs結(jié)果（ExceL表格）；

2. 完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告：擴(kuò)增和反應(yīng)體系、所涉及的引物、探針序列；

3. 客戶所需要的其他相關(guān)資料；