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All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit(一管式第一鏈反轉錄試劑盒)

產品規(guī)格：

貨號	產品名稱	規(guī)格	目錄價
P4204-50	All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit(一管式第一鏈反轉錄試劑盒)	50T	500
P4204-100	All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit(一管式第一鏈反轉錄試劑盒)	100T	900
P4204-1K	All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit(一管式第一鏈反轉錄試劑盒)	10*100T	8560

產品介紹：
      本試劑盒是專為一步法RT-PCR實驗配制的，使用該試劑盒能夠方便快捷的在同一個反應管內完成逆轉錄反應和PCR擴增反應。反應過程中無需打開管蓋添加試劑，避免了污染的同時提高了檢測靈敏度和實驗效率。本試劑盒包括最佳配比優(yōu)化的OneStep Enzyme Mix（包含突變改造TRUEscript M-MuLV H Minus逆轉錄酶、熱啟動HotMaster Taq DNA聚合酶和RNasin抑制劑mix），同時包含適用于逆轉錄和PCR擴增的獨特2 XRT-PCR Mix反應體系。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，與M-MuLV 相比，具有更強的延伸能力和穩(wěn)定性，可用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構建等。同時該酶提高了耐熱性，可以在42-50?C反轉錄，提高了復雜二級結構，GC含量豐富模板反轉錄效率。

產品存儲：－20?C 保存，有效期6個月。

適用范圍：適用于高拷貝、低拷貝基因檢測；部分高GC含量或具有復雜二級結構的RNA模板。

建議反應體系（20 μl-50μl）：
注意：2 XRT-PCR Mix使用前充分融解顛倒混勻（避免劇烈渦旋產生大量氣泡）。短期頻繁使用可放4?C冰箱。
根據下表冰上配制反應液：

Components	Volume	Final Concentration
2×RT-PCR Mix	10 μl	1 X
Forward Primer（10μm）	0.4 μl	0.2 μM
Reverse Primer（10μm）	0.4 μl	0.2 μM
TRUEscript Enzyme Mix	0.8 μl	-
RNA template	X μl	1 pg-1μg
RNase free H2O to final volume	20 μl	Not applicable

注意：引物濃度請以終濃度0.2-0.6μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。如果同進行多個反應，先按比例配成混合液，振蕩混勻后，按每管 20-Xμl (X為模板量)分裝。

PCR擴增：
1. 將配制好的反應體系混勻、離心后。
2. 將熱循環(huán)儀預熱到42?C，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，按以下反應條件進行反應。
擴增程序：

	溫度	時間	循環(huán)數(shù)
1	42°C	30分鐘	1
2	94°C	2-3分鐘	1
3	94°C	30 秒	30-40
	50-60°C	30 秒
	72°C	1-2kb/分鐘
4	72°C	5-10分鐘	1
5	4°C	保溫

注意：可根據擴增產物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以，在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數(shù)。

注意事項：
●避免RNase污染。
●為保證反應成功建議使用高質量的RNA模板
●不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，過多的RNA會抑制反應，建議根據反應調整模板用量。
●不能使用Oligo(dT) 和Random Primer 合成cDNA。