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First Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser

產(chǎn)品規(guī)格：

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	目錄價(jià)
P4203-50	First Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser	50T	750
P4203-100	First Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser	100T	1290
P4203-1K	First Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser	1000T	10900

產(chǎn)品介紹：

本產(chǎn)品是一種高效、穩(wěn)定、快速并可以去除基因組DNA污染的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。本試劑盒為一管式反轉(zhuǎn)錄預(yù)混Mix，5 × TRUE RT MasterMix 中含有反轉(zhuǎn)錄第一鏈合所需的所有試劑（TRUEscript Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer）。 通常Real Time RT-PCR等實(shí)驗(yàn)需要先用DNase I消化去除RNA中殘留的基因組DNA(gDNA) ，但是傳統(tǒng)DNase I 處理復(fù)雜并容易造成 RNA 的降解和損失。本試劑盒中使用了具有DNA分解活性的特殊 4 × gDNA Eraser Mix 2分鐘消除gDNA殘留，不需要DNase 消化和后續(xù)繁瑣步驟。 

產(chǎn)品存儲(chǔ)：－20℃ 保存，有效期12個(gè)月

適用范圍：第一鏈cDNA合成，去除RNA中殘留的gDNA，可用于高拷貝、低拷貝基因的檢測(cè)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

不需要傳統(tǒng)繁瑣的DNase I消化，采用gDNA Eraser Mix極大簡(jiǎn)化了DNA殘留的清除流程。全預(yù)混的反轉(zhuǎn)錄mix和gDNA Eraser Mix大大減少了加樣工作量和降低RNA污染幾率。同時(shí)2種mix在-20℃不凍結(jié)可以直接使用，節(jié)約了化凍和混勻時(shí)間，使用方便。 特殊優(yōu)化的oligo dT和N6隨機(jī)引物配比，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始并具有相同的逆轉(zhuǎn)錄效率，最大程度保證了qPCR結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。反轉(zhuǎn)錄效率高。只需42℃，20 min即可完成cDNA第一鏈的合成。合成cDNA片段長(zhǎng)度最高可達(dá)12 kb。

操作步驟：

第一鏈cDNA合成(以20 μl反應(yīng)體系為例)
1.在RNAse free管里面加入以下成分:(建議使用PCR管并在PCR儀器上進(jìn)行)

Components	Volume
Total RNA/mRNA	≤ 12 μl *
4 × gDNA Eraser Mix	4 μl (見注意事項(xiàng)3)
RNase free H2O to final volume	to 16 μl（補(bǔ)足到總體積16 μl）

* Total RNA不超過(guò)2 μg，mRNA不超過(guò)200 ng (20μl體系)

2. 輕輕混勻，42℃孵育2分鐘（或者37℃孵育5分鐘）。

3. 瞬間離心收集反應(yīng)液至管底，置冰上，繼續(xù)在同一管加入如下成份：

Components	Volume
5 × TRUE RT MasterMix	4 μl (見注意事項(xiàng)3)

4. 輕輕混勻（總體積20 μl）
如使用mRNA模板是來(lái)源于真核細(xì)胞（如人、小鼠的組織細(xì)胞）含有Poly(A)尾結(jié)構(gòu)，42℃孵育15-20 min。

如使用mRNA模板是來(lái)源于原核細(xì)胞（細(xì)菌）或者病毒等不含Poly(A)尾結(jié)構(gòu)，25℃孵育10 min，42℃孵育15-20 min。

5. 85℃加熱 5 min 失活TRUEscript Hˉ RTase和gDNA Eraser。

6. 置冰上，合成的cDNA可以用于下一步熒光定量PCR。需較長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)，請(qǐng)于-70℃保存，避免反復(fù)凍融。

RT-qPCR：

取1/10-1/5 體積(2-4 μl)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板或者根據(jù)需求調(diào)節(jié)使用量。若后續(xù)實(shí)驗(yàn)為實(shí)時(shí)熒光定量PCR，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加量應(yīng)不超過(guò)PCR體系終體積的1/10，例如50 μl 的PCR反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加量應(yīng)不超過(guò)5 μl。按照廠家熒光定量PCR試劑說(shuō)明書進(jìn)行下一步熒光定量PCR。

注意事項(xiàng):
1. 避免RNase污染。
2. 為保證反轉(zhuǎn)錄成功建議使用高質(zhì)量的RNA樣品。
3. 4 × gDNA Eraser Mix 、5 × TRUE RT MasterMix  非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。