產(chǎn)品中心

組織/細胞基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)

Tissue/Cell DNA Extraction Kit

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
獨特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點：
1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
  多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可達30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

三.適用范圍：
    適用于快速提取各種動植物細胞/組織基因組DNA。

四.儲存條件：
1.結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2.為避免降低活性、方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1ml滅菌水溶解，因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

五.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2.需要自備1XPBS(磷酸鹽緩沖液),和異丙醇。
3.實驗前將需要的水浴先預熱到70℃?zhèn)溆谩?br /> 4.結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時可以適當稀釋。

關(guān)于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時平衡液預處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

六.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
  提示：第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
  提示：平衡液預處理吸附柱備用：使用平衡液預處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關(guān)于平衡液的使用”。

1.組織培養(yǎng)細胞
 a.收集約105-106懸浮細胞到一個1.5ml離心管；對于貼壁細胞，應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來收集。
 b.13,000rpm離心10秒，使細胞沉淀下來。棄上清，留下細胞團和大約10-20μl殘留的液體。
 c.加200μl 1XPBS重懸洗滌細胞，13,000rpm離心10秒，使細胞沉淀下來。完全吸棄上清, 將細胞沉淀重懸于180μl 1XPBS中。
 d.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。
   可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結(jié)合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
 e.冷卻后加100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
 f.將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
 g.接操作步驟項下4。

2.動植物組織（例如鼠肝腦或者植物葉片）
 a.新鮮或者解凍的組織在液氮中研磨成細粉后或者用解剖刀切成小碎塊（切成微塊可以提高產(chǎn)量）后取20-50mg，轉(zhuǎn)入裝有180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
 b.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
 c.將裂解物放置在55℃水浴1-3小時或者直到組織消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
   可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
 d.加入200μl 結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。
 e.冷卻后加100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
 f.用1ml的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
   如果有不溶組織物可能堵住槍頭，可將槍頭在吸水紙上輕蹭去除不溶物；如果吸上來的混合物少則可以將槍頭和不溶物一起棄去，該做法是為了去除不溶物，以免堵塞離心柱。
 g.接操作步驟項下4。

3.動物組織（鼠尾）
 a.將0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎（一定要剪0-2cm范圍內(nèi)的尾巴尖，否則裂解效果不好），或者在液氮中研磨組織成細粉后，轉(zhuǎn)入裝有180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
 b.加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
 c.將裂解物放置在55℃水浴3小時或者直到組織消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
   可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
 d.用一個1ml不帶針頭的一次性輸液器抽打裂解物2-3次。
 e.加入200μl 結(jié)合液CB和100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。
 f.13,000rpm 離心5分鐘，將上清加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
 g.接操作步驟項下4。
  上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低產(chǎn)量，必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻。

4.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

5.加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

6.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

8.取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

 洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

9.DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。

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