產(chǎn)品中心

無內毒素高純質粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)

Endo-Free HighPure Plasmid Mini Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
   本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，通過獨特的內毒素清除劑選擇性結合離心除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點：
1.離心吸附柱內硅基質膜采用進口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質量不穩(wěn)定的弊端。
2.獨特工藝配方清除內毒素，內毒素含量極低（<0.1 EU/μg DNA），細胞轉染效果極佳。也可直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

三.儲存條件：
1.第一次使用時，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液P1后（終濃度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質粒可能會有微量RNA殘留，在溶液P1中補加RNase A即可。
2.環(huán)境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

四.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2.提取質粒的量與細菌培養(yǎng)濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有關。一般高拷貝質粒，建議接種單菌落于1.5-4.5 ml加合適抗生素的LB培養(yǎng)基， 過夜培養(yǎng)14-16個小時，可提取出多達20μg的純凈質粒。如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?0kb的大質粒，應適當加大菌體使用量，使用5-10 ml過夜培養(yǎng)物，同時按比例增加P1、P2、N3的用量，其它步驟相同。
3.得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過90%。
4.質粒DNA確切分子大小，必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的的質粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其大小。
5.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

關于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應而影響其核酸的結合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團，提高核酸的結合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時平衡液預處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

五.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
 第一次使用前請先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
 將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后置于2-8℃保存。

1.取1.5-4.5 ml過夜培養(yǎng)的菌液，12,000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清，收集菌體。收集超過1.5 ml菌液， 可以離心棄上清后，在同一個1.5ml管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2. 用250μl溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

3.加250μl的溶液P2，溫和地上下翻轉6 -8次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。
溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應超過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。

4.加250μl溶液N3，立即溫和地上下翻轉6 -8次，充分混勻時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13,000rpm離心10分鐘，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。
加入溶液N3后應該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。

5.加入0.1體積(上清的體積的10%，約80μl)的內毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒旋轉混勻，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置5分鐘直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次。
內毒素清除劑加入上清后，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮（或稍渾濁）。

6.常溫放置3-5分鐘，溫度恢復室溫溶液很快變?yōu)闇啙幔嵉够靹颉?br /> 如室內溫度較低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，將很快變渾濁，顛倒混勻。

7.室溫14,000 x g離心10 分鐘分相 。上層水相含DNA，下層藍色油狀相含內毒素和其它雜質。將含DNA的上層水相轉移到新管（注意不要吸到藍色油狀層，里面含內毒素等雜質），棄油狀層。

平衡液預處理吸附柱：使用平衡液預處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，

8.向上層水相中加入0.5體積異丙醇（約370μl）后充分顛倒混勻后分兩次（每次不超過700μl）轉入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。直到所有混合溶液通過此吸附柱。

9.加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。再加入600μl漂洗液WB，重復漂洗一次。

10.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

11.取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50-100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于30μl，體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產(chǎn)量。