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產(chǎn)品規(guī)格：

產(chǎn)品介紹：

本體系是用于染料法（SYBR Green I）實(shí)時(shí)熒光定量的預(yù)混體系。產(chǎn)品含有優(yōu)化濃度的HotStart Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg2+、反應(yīng)緩沖液和穩(wěn)定劑等成分。主要用于基因組DNA靶序列和RNA反轉(zhuǎn)錄后cDNA靶序列的檢測(cè)，如基因表達(dá)分析，拷貝數(shù)分析，適用于不同類型熒光定量PCR。

本體系為2×SYBR Green qPCR(Antibody)專用預(yù)混液，使用時(shí)只需加入模板、引物和水，使其工作濃度為1×,即可進(jìn)行反應(yīng)。精心研制的抗體法熱啟動(dòng)Taq酶，配合反復(fù)優(yōu)化的Buffer，增強(qiáng)了在低濃度和復(fù)雜模板上的擴(kuò)增效率，具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度地減少人為誤差、節(jié)約PCR實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間、降低污染幾率。

產(chǎn)品存儲(chǔ)：

－20 ℃ 避光保存至少6個(gè)月，使用前充分融解混勻。短期使用可放在4 ℃，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 適用于2×SYBR Green qPCR專用預(yù)混液，可以快速，準(zhǔn)確地對(duì)目的基因進(jìn)行分析，如基因表達(dá)分析，拷貝數(shù)分析，適用于不同類型熒光定量PCR。

2. 即用型2×預(yù)混熒光定量mix，PCR反應(yīng)配置時(shí)，只需加入預(yù)先設(shè)計(jì)好的上下游引物，模板和滅菌蒸餾水即可進(jìn)行反應(yīng)，使用方便。

3. 95℃ 3min完全熱啟動(dòng)，完全避免了非特異性反應(yīng)的發(fā)生，配合反復(fù)優(yōu)化的Buffer，增強(qiáng)了在低濃度和復(fù)雜模板上的擴(kuò)增效率，具有擴(kuò)增效率高，擴(kuò)增靈敏度高，擴(kuò)增特異性好等特點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1．反應(yīng)液的配置分裝，務(wù)必使用無(wú)污染的新吸頭，EP管，盡量避免污染。

2．溶解所有用到的試劑，輕柔上下顛倒混勻，短暫瞬時(shí)離心將溶液甩至管底；

3．按下列組份配制qPCR混合液，將除模板以外的試劑混成mix，再分裝到單個(gè)PCR管內(nèi)，最后加入模板DNA。

建議PCR條件:(以25，50 μl反應(yīng)體系為例，反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行)

4．短暫瞬時(shí)離心后放入熒光定量PCR儀中運(yùn)行，qPCR反應(yīng)程序如下：

*當(dāng)兩步法擴(kuò)增效率不好的時(shí)候建議選擇三步法進(jìn)行qPCR反應(yīng)：

說明：本制品兼容性強(qiáng)，適用于不同廠家、型號(hào)的熒光定量PCR儀，絕大多數(shù)情況下使用二步法和三步法均可獲得良好效果。在實(shí)際使用中可以根據(jù)機(jī)型推薦和具體情況對(duì)程序加以微調(diào)。一般來(lái)說，二步法擴(kuò)增特異性高，三步法擴(kuò)增效率高。如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴(kuò)增；若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，可嘗試加長(zhǎng)延伸時(shí)間或者進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增。

注意事項(xiàng)：

1．反應(yīng)液的配置分裝，務(wù)必使用無(wú)污染的新吸頭，EP管，盡量避免污染。
2．解凍2 x SYBR Green qPCR Mix(Antibody)，上下顛倒輕輕混勻混合，避免氣泡，瞬時(shí)低速離心后使用。
3．引物終濃度應(yīng)在0.1-0.6μM之間進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般情況下，終濃度為0.2μM的引物可以得到較好的結(jié)果；
4．模板量：對(duì)于基因組DNA模板量用量10ng-100ng；對(duì)于模板是反轉(zhuǎn)后得到的cDNA，使用體積不超過qPCR反應(yīng)液總體積的1/10，即20ul體系建議最多加入2ul cDNA，以此類推。
5．變性時(shí)間設(shè)置：建議預(yù)變性時(shí)間設(shè)為95℃，3min，復(fù)雜或高GC模板適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間至5 min，變性時(shí)間設(shè)為95℃，10 sec，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整。
6．退火溫度和時(shí)間設(shè)置：請(qǐng)根據(jù)引物的Tm值和目的基因的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整，退火溫度和時(shí)間設(shè)置。
7．50×ROX Reference Dye用于校正加樣孔之間的體積誤差和熒光信號(hào)誤差，不用Reference Dye校正的qPCR擴(kuò)增儀器，使用時(shí)無(wú)需添加ROX。使用于以下熒光定量?jī)x器，50×ROX Reference Dye使用方法如下：