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ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實驗,是目前廣泛應用于各種抗原抗體檢測的方法,主要有靈敏度高和特異性強的特點。ELISA操作步驟看似簡單,整個測定過程中卻有諸多影響因素,導致檢測結果可能與實際結果偏差較大。為幫助大家分析實驗中常見問題,我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結于下表:
問題一:高背景或陰性對照值偏高
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可能原因 |
建議 |
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陰性對照孔被陽性對照或樣品污染 |
洗滌時,勿將洗液溢出孔外。 |
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洗滌不充分 |
確保在洗滌時每個孔都充滿了液體,確保將殘余液體從孔中移除。 |
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酶結合物過濃 |
請檢查酶結合物是否按說明書規(guī)定稀釋 |
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孵育溫度過高 |
檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定 |
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底物在使用前曝光 |
應保存在暗處,避光。 |
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讀板前停留時間過長 |
加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù) |
問題二:陽性對照值偏低或低吸光度
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可能原因 |
建議 |
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蒸發(fā) |
各步之間,須使用封版膠密封反應板。 |
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溫度不均勻 |
校準孵育箱,勿疊放反應板。 |
問題三:邊緣效應
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可能原因 |
建議 |
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蒸發(fā) |
各步之間,須使用封版膠密封反應板 |
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溫度不均勻 |
校準孵育箱,勿疊放反應板 |
問題四:標準曲線不佳
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可能原因 |
建議 |
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倍比稀釋標準品時未混勻 |
稀釋標準品的每一步均需混勻 |
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過早稀釋 |
標準品在快要使用時稀釋 |
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加入的體積不正確 |
使用校準過的移液器,快速、等量的將標準品分配到各個微孔中 |
問題五:標準曲標準曲線良好,但樣本無檢測信號
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可能原因 |
建議 |
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樣本中無檢測物或檢測物含量極低 |
設置內(nèi)參,重新實驗 |
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樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測 |
作適當稀釋,降低其他物質(zhì)的干擾,或作系列稀釋,檢測回收率。 |
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樣本中檢測物濃度過高,Hook效應導致假低值 |
適當倍數(shù)稀釋樣本,檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi)。 |
問題六:重復性較差
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可能原因 |
建議 |
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微孔中有氣泡 |
用針尖挑破氣泡 |
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試劑未混勻 |
確保充分混勻試劑 |
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樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 |
使用前離心 |
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微孔包被面被吸頭劃破 |
加液時小心操作 |
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使用用過的封板膠紙 |
每次須使用新的封板膠封住反應孔 |
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